當抗原遇到相應的抗體便形成抗原抗體復合物（Ag＋Ab ↔Ag －Ab），當用放射性同位素標記抗原再與相應的抗體結合便形成標記抗原和抗體復合物。即： Ag Ab↔ Ag－Ab。當標記抗原和未標記抗原一起加入相應的抗體時則兩種抗原產(chǎn)生相互的競爭，而生成有標記抗原和抗體復合物以及非標記抗原和抗體復合物。生成標記抗原抗體復合物與非標記抗原的含量在一定的限度內(nèi)是呈反比的，所以利用這個原理去測定未知抗原或抗體。

﹡Ag Ag Ab Ag（F）

＋Ab

Ag Ag Ab（B） Ag

如果Ag多則*Ag－Ab（即結合抗原B）生成量減少，*Ag（即游離抗原F）的剩余量就多。相反，Ag少，則*Ag－Ab生成量就多，*Ag的剩余量就少。通過檢測游離抗原F和結合抗原B，就可知未知抗原的存在與否以及含量的多少。

1、完全抗原 為了保證免疫反應的特異性，對放射免疫抗原要求的純度較高，必須在90%以上。通常采用電泳、凝膠過濾、離子交換層析等技術獲得較高純度的抗原。純化的抗原必須經(jīng)過純度鑒定才能使用。鑒定辦法：通過電泳只出現(xiàn)一條沉淀線，或者以圓盤電泳進行純度分析。

2、半抗原 要獲得較好的免疫原性，必須將半抗原與蛋白質(zhì)大分子的載體結合起來形成一個完全抗原。結合的載體，通常包括血清白蛋白、 球蛋白、纖維蛋白、甲狀腺球蛋白、雞卵蛋白等。連接方式則因半抗原的功能基團與蛋白質(zhì)載體功能基團所決定。常用的連接劑有二亞胺、二異氰酸、過碘酸鹽等。

見第八章免疫球蛋白的制備與提純。

1．放射性同位素的選擇 選擇同位素的原則。

⑴ 定方法簡單、經(jīng)濟、便于推廣應用。

⑵ 易于防護。

⑶ 同位素與標記物結合好，不易從標記物上脫落。

⑷ 對標記物不引起輻射損傷，使蛋白變性。

⑸ 具有較高的計數(shù)效率。

目前常用的同位素有³H、¹²⁵ I，其它還有¹⁴C、³⁵S和³²P等。① ³H 因所有的有機化合物中均含有氫，用³H來置換氫，不至于影響其原有化合物的化學性質(zhì)。³H的半衰期長，是一個弱 衰變，能量低，便于防護。一次標記可以使用較長時間，采用閃爍儀測量，測量效力可達60%。³H標記要求條件較高，一般需由專門機構來承擔，不易推廣；② ¹²⁵I 碘標記的化合物比度高，標記方法簡便，而且標記物可在碘化鈉晶體﹟型計數(shù)器上直接測定。¹²⁵I發(fā)射 射線，含有酪氨酸的蛋白質(zhì)和多肽均可用放射性I標記。目前，連接標記技術已有相當發(fā)展，致使許多非蛋白質(zhì)和多肽的半抗原也可以用碘來標記。另外碘的放射能量較大，半衰期也較短。

雖然¹²⁵I的放射比活性僅為¹³¹I的13%，但¹²⁵I的半衰期較¹³¹I長，同位素豐度大，輻射損傷小，計數(shù)效率也較高，因此¹²⁵I比¹³¹I更為常用。

表 各種標記同位素的性質(zhì)比較

2．標記方法 目前常用的是碘標記法。碘化標記的方法很多，如氯化碘法、乳過氧化酶法、過氯酸法和連接標記法等。但比較起來，氯胺T法最為簡便，效果好，易于采用。

氯胺T碘化標記法的原理：氯胺T是一種氧化劑，在水溶液中可以緩慢地釋放次氯酸，因而可以在標記的過程中形成一種能產(chǎn)生溫和氧化效果的中間體，它可使放射性碘離子氧化而呈活潑形式的碘離子，并取代抗原分子中酪氨酸苯環(huán)羥基鄰位的一個或二個氫原子，使之成為含有碘化酪氨酸的多肽鏈。其記過程為：

⑴ 將蛋白質(zhì)抗原以0.5Mol/L pH7.5PB液稀釋為20μg/μl，取5μl~10μl。

⑵ 取Na¹²⁵I 5μl(含2mci~3mci)。

⑶ 將1mg氯胺T溶于0.5Mol/L pH7.5PB液 0.1ml中。

⑷ 再將Na¹²⁵I和氯胺T分別緩緩加入蛋白質(zhì)液中，于冰浴中邊加邊攪拌，加完后再攪拌5min。

⑸ 加0.1ml(含3mg)偏重硫酸鈉(以PB液配制)。

⑹ 再加1%碘化鉀液1滴，看液體是否完全透明。如仍呈棕色，應繼續(xù)加少許的偏重硫酸鈉。

⑺ 過SephadexG50柱，取第一峰，即為碘標記的蛋白質(zhì)抗原。

3．標記的最佳條件

⑴ 放射性碘比活性要高。

⑵ 反應體積要小。

⑶ 標記反應的pH值，以pH7.5為宜，超過8.5，碘則取代酪氨酸以外的其它成分。

⑷ 氯胺T的用量必須事先測定。其方法為定出在標記的蛋白質(zhì)存在時，10%的三氯醋酸能沉淀最大量放射性碘所需要的最小量的氯胺T。氯胺T的用量必須適當。用量少，雖能滿足反應的要求，但產(chǎn)率低；用量大易使蛋白質(zhì)變性。

⑸ 蛋白質(zhì)的濃度決定碘化的效率。對含量中等的氯胺酸的蛋白質(zhì)而言，在蛋白質(zhì)濃度為1mg/ml，蛋白質(zhì)的回收率為100%，濃度為300μg/ml，則為80%～90%，當濃度降至50μg/ml時，則回收率只有60%～70%。

4．標記物的鑒定

⑴ 放射性化學純度鑒定是指某一化學形式的放射性物質(zhì)的放射強度在該樣品中所占放射性總強度的百分比。鑒定方法為：取標記的蛋白質(zhì)或多肽抗原液少許，加入1%～2%載體蛋白及等量的15%三氯醋酸，搖勻靜置數(shù)分鐘后，3 000r/min離心15min分別測上清液(含游離碘)及沉淀(含標記抗原)的放射活性。一般要求游離碘含量占總放射性碘的5%以下。標記抗原貯藏較久后，仍有部分放射碘從標記物上脫落下來，使用時應除去后再用，否則影響放射免疫分析的精確度。

⑵ 免疫化學活性鑒定：采用碘標記的抗原，通常由于氧化劑的作用可引起部分活性的損傷，而采用³H、¹⁴C等標記的抗原，則不改變抗原的化學結構。免疫活性的檢查方法：以小量的標記抗原加過量的抗體，在適當?shù)臈l件下充分反應后，分離B、F，分別測定其放射性，算出百分結合率。此值應在80%以上，最大可超過90%。該值越大，表示標記的免疫化學活性損失越少。

⑶ 放射強度：放射性強度以比度表示。即單位重量抗原的放射性強度。比度越高，敏感性越高。因此根據(jù)測定需要的敏感度，要求適當比度的標記抗原。標記抗原比度的計算是依據(jù)放射性碘的利用率。

分離方法	(B) 抗原抗體復合物	(F) 游離抗原
平衡透析 清蛋白或葡聚糖衣 活性炭吸附 凝膠過濾 微孔濾膜過濾 電泳和層析電泳 雙抗體法 固相抗體法 硫酸胺沉淀法 聚乙二醇(分子量6 000)	在透析袋內(nèi) 不被活性炭吸附離心 后于溶液中 先被洗脫 在醋酸纖維膜上 在 球蛋白電泳帶 被第二抗體沉淀 結合到固相物上 離心后于沉淀中 離心后于沉淀中	袋內(nèi)外濃度相等 被活性炭吸附于沉淀中 后被洗脫 通過濾膜被洗掉 以其自己的電泳泳動度移動 離心后在上清液中 在溶解相中 在溶液中 在溶液中

以此抗體用量，加入不同稀釋度的已知抗原和標記的抗原作用一定時間后，分離B、F，測B的放射性，以標記Ag與抗體復合物的脈沖數(shù)或結合率為縱坐標，以未標記抗原濃度的對數(shù)為橫坐標作圖。如得不到直線可通過logit計算，將曲線換成直線。在坐標上，曲線的斜率最大的部分是放射免疫測定的工作范圍。斜率越大，敏感性越高，測定范圍小。斜率小，工作范圍大，而敏感性就較差。