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        DNA片段回收與純化

        放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-28
        質(zhì)粒、噬菌體等經(jīng)酶切,電泳;PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后,常常需要對(duì)一些DNA電泳片段進(jìn)行回收和純化,用于亞克隆、探針標(biāo)記等。DNA回收和純化常用方法有壓碎法、低融點(diǎn)瓊脂糖法、凍融法等,也有現(xiàn)成的試劑盒供應(yīng)。
        一、凍融法
        1. 紫外燈下仔細(xì)切下含待回收DNA的膠條,將切下的膠條(小于0.6g)搗碎,置于1.5ml離心管中;
        2. 加入等體積的Tris-HCl飽和酚(pH 7.6),振蕩混勻;
        3. -20℃放置5-10min;
        4. 4℃離心10000g×5min,上層液轉(zhuǎn)移置另一離心管中;
        5. 加入1/4體積H2O于含膠的離心管中,振蕩混勻;
        6. -20℃,放置5-10min;
        7. 4℃離心10000g×5min,合并上清液;
        8. 用等體積酚/氯仿、氯仿分別抽提一次,取上清;
        9. 加入1/10體積3M NaAc(pH 5.2)、2.5倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇,混勻;
        10. -20℃,靜置30min;
        11. 4℃離心13000g×10min,棄上清,75%乙醇洗沉淀1-2次,晾干;
        12. 加適量H2O或TE溶解沉淀。
        二、DNA回收試劑盒(QIAquick Gel Extraction Kit Protocol)
        1. 紫外燈下仔細(xì)切下含待回收DNA的凝膠,置1.5ml離心管中,稱(chēng)重。
        2. 加入Buffer QG(每100mg凝膠加Buffer QG 300μl),置50℃水浴10min。
        3. 若回收片段小于500bp或大于4kb,則需加入異丙醇(每100mg凝膠加異丙醇100μl),混勻。
        4. 將小柱放在2ml收集管上,將上述溶液加于柱上。
        5. 4℃離心13000g×1min,棄去收集管中液體。
        6. 加入500μl Buffer QG于柱上,4℃離心13000g×1min,棄去收集管中液體。
        7. 加入750μl Buffer PE于柱上,4℃離心13000g×1min,棄去收集管中液體。
        8. 4℃離心13000g×1min。棄去收集管。
        9. 將柱放于一新1.5ml離心管上,加50μl EB于柱上。放置1min,4℃離心13000g×1min。
        10. 取5μl 回收DNA電泳檢測(cè)。
        三、 注意事項(xiàng)
        紫外燈下切下含待回收DNA的凝膠時(shí),要襯以干凈的塑料薄膜,使用無(wú)DNA污染的新刀片,其目的在于防止外源DNA的污染。
         

         

         
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