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        Southern Blots 技術(shù)

        放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-28

        Southern Blot Flow
        一 基因組酶切和電泳
        在200 μl 微量離心管中加入:
        25 μl DNA樣品(約10μg),
        3μl 限制性內(nèi)切酶(MBI,10 U/ μl)
        5 μl 相應(yīng)的10×buffer,
        補水到50μl。
        然后加一滴礦物油覆蓋, 稍微離心后放于37℃水浴8-12小時。酶切完后,取5μl 酶切DNA樣品于0.8%的瓊脂糖凝膠上檢測酶是否充分。如果酶切充分,灌制0.8%的agrose膠,加入上樣buffer后,在25—30V穩(wěn)壓電泳12—16hrs。
        注意:在southern雜交中對,DNA的質(zhì)量要求較高,否則酶切不完全導(dǎo)致失敗。
        二 轉(zhuǎn)膜
        1 用0.2MHCl 脫嘌呤處理,偶爾輕輕振蕩至溴酚藍(lán)完全變成黃色,大約需要15~30分鐘。然后用水漂洗凝膠2~3次,將水倒盡,加入堿變性液,偶爾輕輕振蕩至溴酚藍(lán)完全恢復(fù)到原來的藍(lán)色(大約需要20~30分鐘)。
        注意:此方法對酶切后目標(biāo)片段大于15kb時用,如果小于15kb最好不要進(jìn)行脫嘌呤處理,否則容易將片段打斷,導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜后結(jié)合不緊密。
        2 取一磁盤架上一洗凈玻璃板,在磁盤中倒入適量的轉(zhuǎn)膜緩沖液,在玻璃板上架兩層長濾紙(30cm左右)(注意不要產(chǎn)生氣泡)搭成鹽橋。(濾紙比膠弱寬)依膠大小裁好尼龍膜,寫好標(biāo)記,正面向下,緊貼于膠上,防止有氣泡產(chǎn)生,接這壓兩張同樣大小的濾紙,不可過大以免短路,膠周圍用X光片壓條。膠應(yīng)反面朝上因為DNA多在膠的底層。堆積吸水紙。上面放一小玻板,板上加一500 g左右的重物。
        注意:防止短路
        3 轉(zhuǎn)膜16---20hrs后,將尼龍膜取下,膠染色,觀察轉(zhuǎn)膜效果。將膜用2xSSC浸泡20分鐘,濾紙吸干后放在烘箱中烘2hrs(80℃)。待用。
        三 雜交
        ¨ 雜交爐與雜交管預(yù)熱至65℃
        ¨ 尼龍膜用2×SSC浸泡
        配置雜交液
        ssDNA沸水變性10min,冰浴10min,置冰浴備用
        Components Volume (ml) Note
        ddH2O 20.7
        50×Denhardts 0.6
        P/H stock 8.1
        20% SDS (OR 10% SDS) 0.3 (OR 0.6)
        Total 30 ml for 2 blots. 65℃預(yù)熱.

        Add prepared ssDNA (10mg/L) ≥0.3 ml
        倒入雜交液,加入尼龍膜,65℃預(yù)雜交4~5小時(新膜)
        注意:趕盡膜與膜之間的氣泡后把幾張膜同時放入雜交管,并用玻棒趕盡膜與管壁之間的氣泡,最后加入雜交液,蓋好管蓋。
        四 探針標(biāo)記
        (for1~2 blots)
        ddH2O 7 ml
        Marker 1.5 ml
        模板DNA 2 ml (about 100 ng)
        沸水變性8min,冰浴10min,瞬時離心
        Add Buffer Primer 7.5 ml
        Add dNTPs(-dCTP) 3 ml
        Add Klenow (about 1.5U) 1 ml (2U/ml)
        瞬時離心
        Add 32p-dCTP 1~2 ml (10~20 uCi per blot)
        37℃ 水浴≥4小時
        五 雜交
        向標(biāo)記探針的離心管中
        Add 等體積TE 25 ml
        Add 10×體積變性劑(雜交液) 250 ml
        沸水變性10min,冰浴10min,將變性好的探針加入到雜交液中,混勻,65℃雜交過夜(12~16小時)。
        六 洗膜
        1. 2×SSC,0.5%SDS 5min
        2. 0.1×SSC,0.1%SDS xmin (RT)
        3. 0.1×SSC,0.1%SDS χmin (65℃)
        (洗膜過程中不斷檢測放射性強度直至200~500)
        濾紙吸干洗液,保鮮膜包好,暗室中壓片,根據(jù)放射性強度暴光若干天。
        沖洗X光片。

        說明:
        由于做southern的整個過程比較復(fù)雜涉及到的試劑也比較多,我這里僅做了個簡要的敘述,但基本的實驗過程已列舉出來了,此過程中的試劑可以根據(jù)具體的實驗要求適當(dāng)調(diào)整,如果各位有那里不清楚或者那些部分需要具體的介紹,請與我聯(lián)系,我們共同討論學(xué)習(xí),另外,做雜交的過程中一定要注意防止同位素泄漏,做好個人的防護(hù)工作。

         

         

         
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