在進行梯度洗脫時，由于多種溶劑混合，而且組成不斷變化，因此必然帶來一些特殊的問題，我們必須充分地重視。

 

1、要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動相。有些溶劑在一定的比例內互溶，超出一定的范圍后就不會互溶。例如：乙腈和1mol/L的醋酸銨（pH5.16）做梯度洗脫，乙腈含量超過70%時就會出現(xiàn)不溶，甲醇和已烷混合，甲醇含量高于30%時就會分層等。當有機溶劑和緩沖溶液混合時還可能析出鹽的結晶體，尤其使用磷酸鹽時需特別小心。

 

2、梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證好的重現(xiàn)性。進行樣品分析前必須進行空白梯度洗脫，以辯認溶劑雜質峰，因為弱溶劑中的雜質富集在色譜柱頭上后會被強的溶劑洗脫出來。用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣，以防止溶劑混合時產生氣泡。

 

3、混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因此在梯度洗脫時常會出現(xiàn)壓力變化，例如純水或甲醇的粘度都比較小，但是當二者以相近的比例混合時粘度會增大很多，此時的柱壓是純水或甲醇為流動相時的兩倍。因此要注意防止梯度洗脫過程中壓力超過輸液泵或色譜柱所能承受的最大壓力。

 

4、每次梯度洗脫之后必須對色譜柱進行再生處理，使其恢復到初始的狀態(tài)。需讓10～30倍柱容積的初始流動相流經(jīng)色譜柱，使固定相與初始流動相達到完全平衡。